新手RNA提取需要注意什么？

在進(jìn)行基因表達(dá)量分析或是構(gòu)建cDNA文庫時(shí)，需要從組織或者細(xì)胞中進(jìn)行RNA提取，獲得純度高、完整性好的RNA，對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。不同組織總RNA提取的實(shí)質(zhì)就是將細(xì)胞裂解，釋放出RNA，并通過不同方式去除蛋白質(zhì)、DNA等雜質(zhì)，最終獲得高純度RNA產(chǎn)物的過程，Trizol法是最為常見也是最經(jīng)典的提取方法。RNA提取過程中，有哪些是值得注意的？

1、Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。Trizol試劑含有苯酚，具有毒性和刺激性，操作過程中注意做好防護(hù)措施，不要滴到皮膚上。2、 RNA提取過程中RNase污染的主要來源是手、唾沫和空氣中的浮沉，注重配帶手套和口罩，樣品盡可能蓋嚴(yán)。3、細(xì)胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全會(huì)降低RNA的得率，因?yàn)橐徊糠諶NA會(huì)殘留在未裂解的細(xì)胞中。細(xì)胞裂解之后要看不見顆粒狀物質(zhì)（結(jié)締組織和骨除外）。4、在清洗和裂解細(xì)胞時(shí)最好在低溫下操作，防止在操作過程中釋放的內(nèi)源RNase降解了RNA。5、RNA提取過程中所使用的塑料制品、玻璃和金屬物品的處理。盡量使用一次性無菌塑料制品。已標(biāo)明RNase-free的塑料制品，如沒有開封使用過，通常不必再處理。玻璃及金屬物品，使用前進(jìn)行DEPC泡制處理，而后進(jìn)行高壓滅菌處理。6、處理存在細(xì)胞壁特別結(jié)構(gòu)的酵母和一些細(xì)菌時(shí)，可以在加入Trizol試劑的同時(shí)加入無RNase的玻璃珠并劇烈振蕩，使細(xì)胞裂解充分。7、由于RNase無處不在，導(dǎo)致RNA降解，因此可以根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行RNA處理，一般RNA提取后隨即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。